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用三种检测法检测结核分枝杆菌的效果
来源:用三种检测法检测结核分枝杆菌的效果网址:http://www.yywszzs.net浏览数:568 

【摘要】目的:对比分析用荧光定量 PCR 技术、抗酸染色法及血清结核抗体检测法检测结核分枝杆菌的临床效果。方法:

2014 4 月~ 2015 4 月期间我院收治的 21 例非结核呼吸系统疾病患者与 48 例结核病患者的临床资料进行回顾性研究。我们分别采集这 69 例患者的痰液标本与静脉血,然后使用荧光定量 PCR 技术与抗酸染色法对其痰液标本进行结核分枝杆菌检测,使用血清结核抗体检测法对其静脉血标本进行结核分枝杆菌检测。对比分析用这三种检测方法检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度。结果:用荧光定量 PCR 技术检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度分别为 100.0% 52.1%。用抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度分别为 100.0% 22.9%。用血清结核抗体检测法检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度分别为 85.7% 77.1%。结论 :与使用抗酸染色法与血清结核抗体检测法相比,用荧光定量 PCR 技术进行结核分枝杆菌检测具有速度快、敏感性高及污染少等优点。该检测方法值得在临床上推广使用。

【关键词】荧光定量 PCR 技术 ;抗酸染色法 ;血清结核抗体检测法 ;结核分枝杆菌 ;比较


结核分枝杆菌是导致结核病发生的主要病原菌。该病原菌的感染性较强。相关的统计资料显示,在我国,约有 4 亿人具有结核分枝杆菌感染史,约有 200 万人患有传染性结核病。大量的临床研究结果证实,进行结核分枝杆菌检测有利于对结核病患者进行早期诊断,可帮助结核病患者制定科学、有效的治疗方案[1]。为了对比用荧光定量 PCR(聚合酶链反应)技术、抗酸染色法及血清结核抗体检测法进行结核分枝杆菌检测的特异性与灵敏度,我们对 2014 4 月~ 2015 4 月期间我院收治的 21 例非结核呼吸系统疾病患者与 48 例结核病患者的临床资料进行了回顾性研究。现将研究结果报告如下:

1   资料与方法

1.1 一般资料

本次研究的对象为 2014 4 月~ 2015 4 月期间我院收治

21 例非结核呼吸系统疾病患者与 48 例结核病患者。这 48 例结核病患者均经既往病史询问、胸部 X 线片检查结核菌培养确诊患有结核病。

1.2 检测方法

1.2.1 用荧光定量 PCR 技术进行结核分支杆菌检测的方法我们所使用的仪器为 BIO-RADiCycler 荧光定量 PCR 检测仪。具体的检测方法为 :在进行检测前,取患者的痰液标本,并将该标本放置在无菌保存管中。在痰液标本中加入等体积的 1M NaOH 溶液,并将其与痰液混合均匀。将该混合溶液在 37的恒温下保温处理 30min,在其液化后对其进行离心处理,然后去除其中的上清液,并在剩余的沉淀物中加入 1ml 的生理盐水。对上述的混合溶液进行震荡悬浮及二次离心处理,然后去除其中的上清液,并进行二次震荡悬浮。对获得的混合溶液进行扩增检验。


1.2.2 用抗酸染色法进行结核分支杆菌检测的方法 取患者的痰液标本,将其中的脓性物质或干酪样物质部分涂厚片,然后对涂片进行抗酸染色。在显微镜下对涂片进行观察。

1.2.3 用血清结核抗体检测法进行结核分支杆菌检测的方法 我们所使用的试剂盒由上海弗洛公司提供。具体的检测方法为:取患者 2ml 的静脉血。对该血液标本进行血清分离。在结核抗体检测塑料板的加样孔内滴入 3 1 号液(包被液 :NaHCO3 2.95g+Na2CO3 1.58g 定容至 1000mL),在其渗入孔内后,向该孔内加入 50μl 的血清标本。在血清标本完全渗入加样孔后,再向该孔内滴入 2 1 号液。在 1 号液渗入加样孔后,向该孔内滴入 2 2 号液(封闭液:NaH2PO4·2H2O 0.85g+Na2HPO4·12H2O 5.15g+ 酪蛋白 10g 定容至 1000mL),再滴入 2 1 号液,然后观察检测结果。

1.3 效果评定标准

我们分别使用三种评定标准对这三种检测方法的检测结果进行评定。其中:用抗酸染色法进行检测效果的评定标准为 :在显微镜的每 100 个视野中找到的抗酸杆菌的数量若≥ 3 个,即表示检测结果为阳性。用荧光定量 PCR 技术进行检测效果的评定标准为 :该检测结果可分为阳性与阴性两种。我院将检测样本的CT ≤ 37.0 作为阳性检测结果的判断标准,将检测样本的 CT

0.0 作为阴性检测结果的判断标准。患者的检测结果若不包括在上述的范围内,则其检测结果无效。用血清结核抗体检测法进行检测效果的评定标准为 :结核抗体检测塑料板块上的 R 处与 C 处若出现淡红色的斑点,提示检测结果为阳性。该塑料板块上的 R 处若未出现淡红色的斑点,C 处出现淡红色的斑点,提示检测结

果为阴性。该塑料板块上的 R 处与 C 处若均未出现淡红色的斑点,提示本次检测存在操作不当的现象或本次检测的结果无效 [2]



1.4 统计学方法

我们使用 SPSS13.0 软件包对本次实验数据进行处理,计量资

料用(x ±s )表示,采用t检验,计数用(%)表示,采用χ2检验,用 P<0.05 表示差异具有统计学意义。



2   结果

用荧光定量 PCR 技术检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度分别为 100.0% 52.1%。用抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度分别为 100.0% 22.9%。用血清结核抗体检测法检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度分别为 85.7% 77.1%。详见下表 1

1  用三种不同检测方法进行结核分枝杆菌检测结果的比

 [n%]


组别

方法

阴性

阳性

阳性率


荧光定量 PCR

23

25

52.1

结核组(48

抗酸染色

37

11

22.9


血清结核抗体

11

37

77.1


荧光定量 PCR

21

0

100.0

非结核组(21

抗酸染色

21

0

100.0


血清结核抗体

18

3

85.7

3   讨论

结核菌培养法、涂片抗酸染色镜检试验及血清结核抗体检测

法是临床上在诊断结核病时常用的检测方法。不过,这三种检测方法各有其弊端。其中,用结核菌培养法检测结核分枝杆菌所用的时间较长,不利于临床上及时是患者制定有效的治疗方案。用抗酸染色检测法检测结核分支杆菌的阳性率较低。其原因可能为患者痰液标本中细菌的数量有限,而且患者排出细菌的频率为间断性的,故检测结果的假阴性率较高。用血清结核抗体检测法检测结核分支杆菌的阳性率较高,但其特异性较差。其原因可能是该检测方法所使用的胶体金技术、免疫层析技术以及固相技术有利于正在生长的结核杆菌大量产生,而且这些病菌的免疫原性均较强。另外,肺结核患者的血清中可能含有的大量 LAM-IgG 也可降低检测结果的特异性 [3-4]


近年来,随着医疗技术的不断发展,临床上逐渐将荧光定量 PCR 技术用于结核病的诊断中,不仅大大地提高了该病的检出率,而且加快了检测的速度[5]。荧光定量 PCR(聚合酶链反应)检测技术采用 UNG-dUTP 抗污染体系,而且用 dUTP(脱氧尿苷)代

dTTP(脱氧胸苷),并结合使用 DNA- 尿嘧啶糖基化酶,形成了 PCR 扩增体系。该检测技术不仅可以对结核分支杆菌进行实时监控,而且可以弥补以往对结核病菌进行重点检测的局限性,利于计算 CT 值。

本次研究的结果显示,用荧光定量 PCR 技术检测结核分枝杆菌的特异性与灵敏度分别为 100.0% 52.1%。这说明,与抗酸染色法与血清结核抗体检测法相比,用荧光定量 PCR 技术进行结核分枝杆菌检测具有检测速度快、检测结果的敏感性高,检测过程的污染少等优点。临床上可将荧光定量 PCR 技术作为检测结核分枝杆菌的主要方法。

参考文献

[1]  方梅,陆巧荣,洪志强 . 分子信标荧光定量 PCR 技术检测结核分枝杆菌方法建立及其临床应用 [J]. 四川大学学报(医学版),

20101501):162-165.

[2]  王旭洲,谢飞来,郑智勇 . 荧光定量 PCR 检测结核 / 非结核分枝杆菌在肉芽肿病理诊断中的应用 [J]. 临床与实验病理学杂志,20132508):884-887+891.

[3]  谭守勇,刘志辉,邓向斌 . 荧光定量 PCR 检测抗酸染色涂片刮削物中结核分枝杆菌 DNA 的可行性 [J]. 实用医学杂志,20122612):2067-2069.

[4]  赵晶,葛存兴,王宏志,等 . 荧光定量基因扩增法与萋 - 尼抗酸染色法检测结核分枝杆菌的比较 [J]. 中国实用医药,20152803):74-75.

[5]  孟小蓉 . 巢式实时荧光定量 PCR 检测结核分枝杆菌 DNA 方法的建立及在结核性胸膜炎的临床应用 [J]. 泸州医学院,20110

02):1205-1206.